С помощью модифицированных форм вируса бешенства ученые могут точно проследить нервные пути

Однажды лунной ночью трое бесшабашных гуляк посреди английских болот были потрясены ужасным зрелищем: «мерзкое чудовище — огромный, черной масти зверь, сходный видом с собакой, но выше и крупнее всех собак, каких когда-либо приходилось видеть смертному. И это чудовище у них на глазах растерзало горло Гуго Баскервиля и, повернув к ним свою окровавленную морду, сверкнуло горящими глазами. Тогда они вскрикнули, обуянные страхом, и, не переставая кричать, помчались во весь опор по болотам». Специалисты по истории медицины считают, что ужас, который собака Баскервилей вызывала у поклонников Артура Конана Дойла, объясняется глубоким следом, который оставило бешенство в сознании британцев того времени. Благодаря способности превратить даже очень добродушных животных в разъяренных монстров с капающей из пасти пеной, вирус бешенства был одним из самых страшных бедствий в истории человечества.

Еще в 1804 г. в исследованиях немецкого врача Георга Готтфрида Цинке (Georg Gottfried Zinke) выяснилось, что вирус в высоких концентрациях присутствует в слюне инфицированных животных. Кроме того, инфекция усиливает выработку слюны, так что ее количество во рту увеличивается. Луи Пастер в 1880-х гг. показал, что мозг тоже заражен вирусом. И то и другое неслучайно. Два столетия исследований показали, что вирус бешенства сочетает предрасположенность к распространению с помощью слюны с челюстей инфицированного животного и дьявольскую способность побуждать его к безумным яростным укусам. Благодаря ловкости эволюции вирус манипулирует мозгом хозяина, чтобы обеспечить собственное эффективное распространение.

Бешенство по-прежнему ежегодно убивает более 59 тыс. человек. Однако вследствие вакцинации и карантина для инфицированных животных оно больше не наводит ужас на жителей развитых стран. А нейробиологи обращают коварную инфекцию на пользу человечеству. Вирус бешенства ловко пробирается от места укуса в мозг, незаметно перескакивая из нейрона в нейрон и оставаясь таким образом незамеченным иммунной системой. Разные исследователи, и в том числе наша группа в Центре исследования нейронных цепей и поведения Sainsbury Wellcome, использовали и усовершенствовали эту способность вируса, чтобы с его помощью определять связи между нейронами.

Мозг человека состоит из миллиардов нейронов, каждый связан с тысячами других; чтобы понять, как такая запутанная сеть проводов обеспечивает наши эмоции и поведение, нужно построить ее карту. Используя модифицированные разновидности вируса бешенства, мы можем увидеть, какие сигналы получает определенный тип нейронов, как электрические сигналы идут от глаза к мозгу и какие типы нейронов контролируют поддержание позы, позволяя нам не упасть. Эта область исследований еще только зарождается, но в будущем подобная информация может пригодиться, чтобы понять механизмы неврологических заболеваний вроде болезни Паркинсона и, может быть, найти для них способы лечения.

От укуса к мозгу

Вначале, при укусе, вирусные частицы (вирионы) попадают в мышечную ткань. Под оболочкой, по форме напоминающей пулю, имеются одиночная нить РНК и белки, снаружи вирус покрыт колючими белками гликопротеинами. Это покрытие обманывает мотонейроны, отростки которых проходят рядом с местом укуса, и вирус проникает внутрь нейрона. Мотонейроны выделяют вещества, побуждающие мышцы сокращаться. Эти нейроны образуют часть длинной цепи, ведущей в мозг жертвы — конечный пункт назначения для
вируса.

Если быть точным, гликопротеин связывается с рецептором в синаптическом окончании нейрона — месте, где происходит передача сигнала на соседний нейрон. Через синапс идет поток сигналов в одну сторону, и этим он похож на дверь в контролируемой зоне аэропорта, через которую можно выйти, но нельзя зайти. Условно «нисходящее» направление синапса — это поток сигналов между нейронами, идущий от мозга к мышцам. Однако вирус бешенства движется вверх, против потока, потому что он должен попасть в мозг. По сути, он обманывает рецептор, чтобы зайти в мотонейрон через ворота, предназначенные для выхода.

Вирусы искусно используют клетки хозяев в своих целях, но мало кто сможет превзойти в этом бешенство. Оказавшись внутри, нарушитель сбрасывает свою гликопротеиновую маскировку, и его РНК приступает к работе, используя материалы и энергию клетки, она создает копии себя и синтезирует свои особенные белки. Затем из этих компонентов собираются новые вирионы. В отличие от многих видов вирусов, которые размножаются так быстро, что зараженная клетка лопается, высвобождая вирусные частицы в межклеточное пространство, вирус бешенства строго контролирует свое размножение, производя ровно столько потомков, чтобы можно было продолжить путь. Таким образом он не причиняет ущерба, достаточного, чтобы насторожить иммунную систему. Он оставляет клетку хозяина неповрежденной и, продолжая двигаться вверх, пересекает синапс и попадает в следующий нейрон. Такая скрытность — одна из причин, почему у этого заболевания столь длинный бессимптомный инкубационный период, у людей он составляет обычно от одного до трех месяцев.

Читать:  «Бросать или нет – вот в чем вопрос»: достойный ли вэйп помощник в борьбе с курением?

Перескочив на новый нейрон, вирион начинает все сначала: раздевается, копирует себя и собирает новые вирусные частицы, которые перемещаются вверх на следующий нейрон. Таким образом вирус бешенства движется по нервной системе, переползая из двигательного нейрона, с которым он встретился в мышечной ткани, через спинной мозг в головной.

К началу 2000-х гг. несколько исследовательских групп, в том числе группы Габриэллы Уголини из Института нейробиологии Университета Париж-Сакле и Питера Стрика, работающего сейчас в Питтсбургском университете, заинтересовались использованием бешенства для прослеживания нейронных связей. Однако расшифровать маршрут, по которому вирус попадает из мышцы в мозг, было непросто. Как нейробиолог, глядя на фотографию нейронов, пораженных вирусом, сможет отличить, один прыжок через синапс совершил вирус, два или более? Первоначально исследователи решили эту проблему, забивая лабораторных животных вскоре после заражения, так что вирус успевал перескочить только через один-два синапса. Такой подход помог выявить некоторые важнейшие пути в мозге, участвующие в регуляции движений. Но у него были и свои недостатки. Не все связи между нейронами одинаковы. Синапс может быть сильным (или слабым), тогда повышается (или понижается) вероятность того, что постсинаптический нейрон передаст сигнал дальше. Синапс может быть расположен близко к телу клетки, а не далеко на конце отростка. И некоторые нейроны образуют единственную связь со следующим нейроном, тогда как другие могут иметь сотни подобных связей. Такая неоднородность означает, что вирус может перемещаться от одного нейрона к другому за разные промежутки времени, а это еще добавляет неопределенности. Что если вирус пройдет через два или три сильных синапса быстрее, чем через один слабый?

Модификация вируса

Для того чтобы обойти эту проблему, ученым понадобилось перестроить вирус бешенства. У молекулярных биологов есть удивительные возможности манипуляций с ДНК: замена генов для них — такое же обычное дело, как приготовление кофе на лабораторной кухне. Однако у дикого вируса бешенства нет ДНК, которой можно было бы манипулировать, у него только РНК. Данное препятствие удалось обойти благодаря обратной генетике, перевернувшей нормальную последовательность событий, при которой РНК синтезируется на основе ДНК. В 1994 г. Маттиас Шнелль и Карл-Клаус Концельманн, оба работавшие тогда в Федеральном исследовательском центре вирусных заболеваний животных в Тюбингене, создали работающий вирус бешенства, используя синтезированную в лаборатории молекулу ДНК. При этом они изменили геном вируса — цепочку РНК, кодирующую его свойства.

Возможность быстро манипулировать с геномом позволила лучше понять, как различные гены вируса бешенства обеспечивают определенные способности вируса. Оказалось, что для способности перемещаться между нейронами нужен единственный ген, отвечающий за синтез гликопротеина.

Если у вируса бешенства удалить из генома ген гликопротеина, вирус сможет заразить клетку, но, однажды проникнув внутрь, он там застрянет. Это открытие сделало бешенство перспективным для ведущих нейробиологических исследований.

В 2007 г. благодаря сотрудничеству между нейробиологами из Института биологических исследований Солка Иэном Уикершемом (Ian Wickersham) и Эдвардом Каллауэем (Edward Callaway) и вирусологами из Института Фридриха Леффлера в Германии Концельманном и Стефаном Финке (Stefan Finke) появилась оригинальная система картирования нервных связей. Первым делом они заменили у вируса бешенства ген, кодирующий гликопротеин, на ген, кодирующий флуоресцентный белок. Модифицированный вирион больше не мог делать гликопротеины, вместо этого на основе информации в его РНК помимо белков вируса бешенства синтезировался флуоресцентный белок, так что инфицированная клетка светилась тем цветом, который выбрал экспериментатор.

Следующим шагом надо было обеспечить наличие гликопротеина в нужном нейроне с помощью какого-то другого генетического механизма. Таким образом, новые вирионы создавали бы гликопротеиновые оболочки и перескакивали через синапс, но лишь однократно. Для этого ученые использовали очень простой вирус, который называется «аденоассоциированный вирус» (AAV), поскольку часто встречается вместе с более крупным аденовирусом. AAV содержит небольшую молекулу ДНК. Исследователи из Института Солка вставили в эту ДНК ген для синтеза гликопротеина вируса бешенства. Вирионы бешенства могли использовать данный гликопротеин, чтобы перескочить через один синапс. Однако они не могли взять с собой этот ген, поскольку это был фрагмент ДНК, а не РНК. Поэтому когда вирион перепрыгивал в следующую клетку, он снова застревал. Если в этот момент посмотреть на мозг зараженного животного, можно увидеть в нервной системе популяцию светящихся клеток, которые были непосредственно связаны с любым нейроном, выбранным исследователями.

Но оставалась одна проблема. Введение вируса бешенства в мозг вызывало прямое заражение любого нейрона, у которого были отростки в месте инъекции. Не имея способа заражать первоначально только конкретные нейроны, ученые не могли различить, какие клетки были заражены напрямую, а какие — после перескока вируса через синапс. Решение пришло из другой области вирусологии: той, которая изучает вирусы птиц. В природе встречаются целые классы вирусов, заражающих только определенные группы животных. Например, саркомо-лейкозные вирусы птиц (ASLV) обычно вызывают рак у кур, но, как правило, не заражают клетки млекопитающих. Как и у бешенства, у этого вируса есть гликопротеиновая оболочка, которая, однако, бывает разной. Различные гликопротеины ASLV называются Env (от англ. envelope — «оболочка»), а дальше буквой обозначается конкретная форма гликопротеина. Каждый подтип связывается со своим рецептором. Например, EnvA связывается с рецептором TVA (птичий рецептор tumor virus A — «опухолевый вирусный А»). Если у клетки нет TVA-рецептора, ее нельзя заразить вирусом, покрытым гликопротеинами EnvA. Такое избирательное взаимодействие позволило ученым направленно заражать вирусом бешенства какой-то один тип нейронов.

Читать:  Секретные данные заставляют сомневаться в холестериновой теории

Вводя ген для гликопротеина EnvA в культуру клеток, зараженных бешенством (процесс называется «псевдотипирование»), Уикершем, Каллауэй и их коллеги заменили исходную гликопротеиновую оболочку вируса бешенства на гликопротеин EnvA из птичьего вируса. Измененный таким образом, вирус бешенства не мог обмануть клетки млекопитающих, чтобы попасть внутрь. Снабдив определенные нейроны, как правило, в мышином мозге, TVA-рецептором, нейробиологи могли быть уверены, что вирус заразит только эту клетку.

Данный нейрон (на самом деле — целый класс нейронов) снабжался также AAV с геном гликопротеина бешенства. Оказавшись внутри, вирус бешенства сбрасывал «костюм цыпленка», надевал свою нормальную оболочку и перескакивал в вышележащий нейрон. Изменив вирус бешенства так, чтобы он заражал вначале только определенную группу «стартовых» нейронов, а потом перепрыгивал лишь однократно, исследователи смогли получить четкую картину связей в мозге.

Настройка вируса бешенства

Простота и элегантность дельта-G-системы бешенства (изобретатели назвали ее так из-за измененного гликопротеина) покорила нейробиологическое сообщество. С помощью этой системы исследователи смогли сразу увидеть, какие нейроны посылают сигналы определенным клеткам. Однако, как и все новые технологии, методика имела свои недостатки. Иногда число выявленных соединений оказывалось достаточно небольшим, около десяти на нейрон.

В 2015 г. Томас Рирдон (Thomas Reardon), Томас Джесселл (Thomas Jessell), Аттила Лосонци (Attila

Losonczy) и я, все мы тогда работали в Колумбийском университете, использовали дельта‑G‑систему, чтобы выявить нервные связи, управляющие движениями. Обнаружив относительно небольшое количество связей с мотонейронами в спинном и головном мозге, мы заподозрили, что получили неполную картину. Другой проблемой была нейротоксичность. Когда вирус оказывался в клетке, она начинала разрушаться и погибала в течение двух недель. Если вирус сам по себе изменяет поведение отдельных нейронов, интерпретация любых наблюдений становится затруднительной.

Шнелль и Кристоф Вирблих (Christoph Wirblich) из Университета Томаса Джефферсона выполнили уникальную работу по биологии вируса бешенства. Мы обратились к ним за помощью, и они сразу поняли, что наши проблемы связаны со штаммом применяемого вируса. Первоначально он создавался для использования в вакцине против бешенства. Эта вакцина содержит специальные штаммы вируса, выбранные людьми из-за высокой скорости размножения, так что многочисленные новые вирионы вырываются из зараженных клеток и привлекают иммунную систему. Стало понятно, как усовершенствовать наш исследовательский инструмент. Поскольку в своих исследованиях мы использовали мышей, наши коллеги вирусологи предложили нам попробовать штамм, который на протяжении многих лет приспосабливался заражать мышиные нейроны.

Исходный вирус этого штамма изначально был получен из дикой природы, но затем «прижился» в лаборатории, неоднократно проходя через мозг мышей или культуры клеток. Таким образом, он приспособился именно к нервной системе грызунов. Собрав отслеживающую систему на основе этого штамма, мы обнаружили, что она помечает гораздо больше соединений, чем мы видели ранее. Более того, специализируясь на уклонении от иммунной системы мыши, вирус производил относительно небольшое количество каждого белка. Таким образом, он меньше напрягал клетку хозяина и позволял нейронам оставаться относительно здоровыми.

Далее мы изменили нашу систему, поставив в вирусе бешенства вместо гена флуоресцентного белка ген светочувствительного белка канал-родопсина (ChR), первоначально найденного у зеленых водорослей. При освещении синим светом эта замечательная молекула открывает канал, позволяя положительно заряженным ионам заходить в определенный нейрон, так что в нем возникает электрический сигнал (при этом инфицированная клетка продолжает светиться, поскольку мы использовали версию ChR, содержащую и флуоресцентный белок). С помощью тонко настроенной вирусной системы мы могли наблюдать, как целые нейронные цепи срабатывают, когда мышь выполняет определенное действие, а также могли включать и выключать их в течение месяца после того, как вирус заразил нейрон. Это дало нам достаточно времени для проведения многих тестов, нужных, чтобы понять, как определенные нервные связи формируют поведение.

Схема связей

Используя разные версии дельта-G-системы бешенства, нейробиологи исследовали много различных связей в нервной системе, чтобы понять, как они участвуют в восприятии и поведении животных. Рассмотрим, например, зрительную систему. Когда свет попадает в глаз, нейроны сетчатки, которые называются ганглиозными клетками, передают сигнал в мозг. Нейробиологи долгое время считали, что эта информация, проходя через промежуточные участки мозга, попадает в итоге в кору больших полушарий — знаменитое серое вещество, — где и происходит обработка. Группа ученых из Института биомедицинских исследований Фридриха Мишера в Швейцарии, которой руководит Ботонд Роска (Botond Roska), использовала систему на основе вируса бешенства, чтобы проследить связи ганглиозных нейронов сетчатки с латеральным коленчатым телом (LGN), той областью мозга, которая считалась просто местом переключения сигнала на пути к коре.

Читать:  Высшее образование защищает от инфаркта

Исследователи показали, что LGN содержит три разных типа нейронов, каждый из которых по-своему обрабатывает зрительную информацию. На самом деле менее трети нейронов служат просто для передачи сигнала дальше на пути от сетчатки в кору. Еще примерно треть получают сочетания разных сигналов от одного глаза, оставшиеся примерно 40% нейронов получают сигналы от обоих глаз. Таким образом, хотя латеральное коленчатое тело расположено недалеко от начала зрительного пути, большинство его нейронов объединяют информацию, поступающую от многих разных источников. Вероятно, это открытие прольет свет на то, как мозг интерпретирует информацию, идущую от глаз.

В Колумбийском университете мы с коллегами изучали нейроны в латеральном вестибулярном ядре (LVN) — той области мозга, которая пытается не дать нам упасть. Представьте, что вы едете в метро и поезд неожиданно останавливается. Не задумываясь, вы сдвигаете ступню, чтобы вернуть равновесие, переступаете и, может быть, хватаетесь за ближайший поручень. Как мозгу удается так быстро активировать правильные группы мышц в различных ситуациях?

Мы выяснили, что в LVN у мышей имеются два анатомически разных типа нейронов, каждый из которых образует свои нисходящие соединения с другими частями нервной системы. Первая группа быстро передает сигнал, когда мозг чувствует, что ваше тело неустойчиво, эти нейроны распрямляют конечности, чтобы расширить опору. Второй тип LVN-нейронов становится активным позже. Они стабилизируют расположение суставов той же конечности, чтобы вернуть тело в исходное положение. Мы могли активировать эти нейроны, просто посветив на LVN синим светом с помощью оптоволоконного кабеля. Когда свет включался, мыши корректировали положение конечностей так, как будто пытались не упасть, даже если они на самом деле не теряли равновесия.

В лаборатории Нао Утида (Nao Uchida) в Гарвардском университете изучали третий важный вопрос: каковы функции нейронов, выделяющих дофамин? Давно известно, что в компактной части черной субстанции (SNc) и вентральной области покрышки (VTA) дофаминергические нейроны отвечают за подкрепление. Там возникает сильное возбуждение, когда животное получает лакомство или когда сигнал предсказывает, что лакомство скоро будет. (Сравните ощущения от поедания шоколадного батончика и когда вы только разворачиваете обертку.) Чтобы понять, какую информацию получают нейроны, ученым нужно выяснить, как они связаны с другими нервными путями. Используя дельта-G-систему, гарвардские ученые обнаружили, что дофаминергические нейроны в SNc получают информацию об актуальности стимула: этот звук разворачиваемой обертки означает, что я получу кусочек шоколада? В то же время в VTA поступает информация о качестве подкрепления: это хороший шоколадный батончик?

При болезни Паркинсона эти дофаминергические нейроны дегенерируют. Интересно, что Утида с коллегами обнаружили также, что основные сигналы к нейронам области SNc поступают из субталамического ядра — небольшой области мозга, которая вместе с другими ядрами участвует в управлении движениями. Возбуждение субталамического ядра с помощью введенного туда электрода, так называемая глубокая стимуляция, обычно помогает ослабить симптомы болезни Паркинсона. Предполагая, что наличие этих входящих сигналов объясняет, почему работает такая стимуляция, нейробиологи заключили, что воздействие на другие области мозга, посылающие сигналы в SNc, может улучшить состояние некоторых пациентов с болезнью Паркинсона.

Таким образом, благодаря сочетанию естественной эволюции и целенаправленной генетической модификации нейробиологи получили удивительно мощный инструмент для исследований. И его еще можно улучшить. Например, получится ли создать вирус, который будет двигаться по нервной цепочке вниз, помечая места выхода сигнала, а не входа? Можно ли создать вирус, который помечает только активные связи между нейронами, высвечивая цепочки, задействованные в определенном типе поведения? Вирус, который манипулировал людьми и терроризировал их на протяжении тысячелетий, теперь служит нам — и мы манипулируем им.

Оставить эмоцию
Нравится Тронуло Ха-Ха Ого Печаль Злюсь
Поддержите проект Мир Знаний, подпишитесь на наш канал в Яндекс Дзен

Оставить комментарий

avatar
  Подписаться  
Уведомление о