Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР): как это происходит?

Зачастую так случается, что только микроскопические количества ДНК могут быть получены напрямую, как например на месте преступления. В связи с этим, для проведения анализов необходимы методы, которые бы позволяли получать большие количества ДНК из малых. Изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1983 году Кэри Мюллисом многие сравнивают с изобретением печатного станка Гутенбергом смотря на то, какие радикальные изменения в нашем мире оно повлекло за собой. Так же как печатная машинка создает многочисленные копии книг, ПЦР производит многочисленные копии определенной последовательности ДНК. Начиная с одного пикограмма образца (в тысячу триллионных раз меньше грамма, около 10000 молекул), ПЦР позволяет получить около микрограмма ДНК (в миллион раз меньше грамма, около 100 триллионов молекул) всего за пару часов.

По своей сути, ПЦР – это искусственная репликация молекулы ДНК. Как это происходит? Образец нагревается, происходит денатурация молекулы ДНК и двойная спираль разрушается. При небольшом охлаждении добавляются специальные праймеры – маленькие образцы ДНК длиной в 20-30 нуклеотидов, которые комплементарны конечным частям ДНК и необходимы для дальнейшего этапа. При температуре в 50 градусов Цельсия праймеры способны присоединиться к молекулам ДНК, но сама ДНК еще остается развязанной. В этот момент добавляется фермент Taq-полимераза, который получают из бактерии Thermus aquaticus живущей в горячих источниках Йеллоустонского национального парка. Благодаря тому, что бактерия приспособлена к жизни при высоких температурах, её белки и ферменты обладают повышенной устойчивостью к температурам и не денатурируют при 50 градусах. Taq-полимераза способна взять одну нить ДНК, к которой уже присоединен небольшой праймер, и достроить всю вторую нить до конца. Весь процесс протекает в трех стадиях, как показано на рисунке. В последнее время, становятся доступными улучшенные термостойкие полимеразы, как например Vent или Pfu, оба из которых изолируются из бактерий живущих рядом с геотермальными источниками на дне океана. Оба этих фермента гораздо более аккуратные по сравнению с Taq. Сейчас ПЦР автоматизирована и около 30 циклов повторений трех предыдущих шагов может быть проведено в течение часа, теоретически выдавая увеличение количества молекул ДНК в 2^30 раз, что примерно в триллион раз больше чем было изначально. На практике, к сожалению, эффективность каждого цикла чуть меньше 100% и экспериментальное увеличение количества молекул достигает миллиона или ста миллионов.

Многие из вас наверняка видели фильмы или сериалы, в которых преступников определяют по “отпечаткам” ДНК. И не только преступников, с помощью ДНК так же проводят тест на отцовство. Все эти тесты основаны на том, что ДНК содержит особые не кодирующие участки ДНК, которые повторяются определенное количество раз. Эти участки называются короткие тандемы повторы (STR). Более того, у каждого человека (за исключением близнецов) эти участки разные, поэтому их можно использовать для идентификации того или иного человека.

Судебно-медицинские лаборатории в США договорились использовать 13 участков STR для идентификации индивидуумов при расследовании преступлений. Была также создана единая база данных, содержащая последовательности разных людей в этих тандемных повторах. Когда образец ДНК обнаруживается на месте преступления, его подвергают реакции со специальными ферментами, которые вырезают STR участки. В дальнейшем, эти фрагменты увеличиваются в количестве с помощью ПЦР, и потом уже подвергаются анализу с целью расшифровки последовательности нуклеотидов и частоты их повторений.

Если последовательность в этих тандемных повторах ДНК для определенного человека из базы данных совпадает с той, которая была найдена на месте преступления, то с вероятностью в 82 миллиарда к одному можно утверждать, что ДНК принадлежит одному и тому же человеку. В тестах на отцовство, когда ДНК отца и ребенка похожи, но не идентичны, вероятность отцовства может быть определена с вероятностью ста тысяч к 1. Анализируя Y хромосому у мужских особей семьи, можно определить отцовство даже спустя несколько поколений. На Западе довольно таки знаменит один пример подтверждающий это утверждение. Однажды распространился слух, что у третьего президента США Томаса Джефферсона были любовные связи со своей рабыней Салли Хемингс.

Никто не знал наверняка было ли это правдой до тех пор, пока не провели анализ ДНК. И хоть у Джефферсона не было прямых потомков по мужской линии, Y хромосома потомков брата его отца почти совпадала с той, которую обнаружили у одного из 8 детей Салли – Эстона Хемингса. И хоть “смешивание” геномов однозначно, мужчина который ответственен за это не может быть определен с абсолютной точностью.

Помимо всего прочего, анализ отпечатков ДНК широко используется для диагностики и обнаружения генетических заболеваний, как внутриутробно так и в новорожденных. Кислотный фиброз, гемофилия, болезнь Хантингтона, болезнь Тея Сакса, серповидноклеточная анемия, талассемия – и это еще не полный список всех тех болезней, которые могут быть диагностированы в самом раннем времени, позволяя применять своевременные методики лечения. Более того, изучая отпечатки ДНК людей с той или иной болезнью, можно постепенно найти закономерности связанные с её возникновением, и возможно найти ключ к её лечению.